الفهرس 
LIST OF CONTENTSOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 104 |  |  |
| | | from | 104 | | |
Abstract
يساهم فشل المبيض المبكر (POF) بشكل كبير في العقم عند النساء الشابات. ويتم اكتشافه بعد العلاج الكيميائي للسرطان، وخاصة مع الأدوية السامة للخلايا مثل عقار السيكلوفوسفاميد (CYP). العلاج بالهرمونات البديلة (HRT) هو دواء يستخدم على نطاق واسع لتحسين إفراز الهرمونات وعلاج فشل المبيض المبكر (POF). ومع ذلك، فإن العلاج التعويضي بالهرمونات على المدى الطويل يزيد من خطر الإصابة بسرطان الثدي وأمراض القلب والأوعية الدموية. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير علاج آمن وفعال لمرض POF. تم تصميم البحث الحالي لتحديد مزايا الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كعلاج لظروف POF في نماذج الفئران الأنثوية.
تم إجراء قياسات مختلفة لدراسة تاثير عقار السيكلوفوسفاميد من خلال تحليل السيرم للهرمونات الجنسية ومستويات الحديد وتحليل العد الكامل للخلايا الدموية. تم فحص التشريح المورفولوجي للمبيض بواسطة صبغة HE و الصبغة المناعية لبروتين Caspase-3 وتكسير الحمض النووي، كما تم اختبار مضادات الأكسدة المبيضية والإجهاد التأكسدي. علاوة على ذلك، تم تقييم مزايا العلاج بواسطة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كعلاج لظروف POF الناجمة عن CYP في نماذج الفئران الأنثوية المستحدث فيها فشل المبيض المبكر.
وقد أجريت هذه الدراسة على عدد 40 من إناث الفئران البيضاء متوسط أعمارها 8 أسابيع وأوزانها بين 180- 220 جرام. وقد قسمت الفئران إلي أربعة مجموعات متساوية اشتملت كل مجموعة على عدد 10 فأراً وتم توزيعها كالأتي:
المجموعة الأولي: ( المجموعة الضابطة الطبيعية): اشتملت على 10 فئران , تم تغذية الفئران نظام غذائي عادي دون أي علاج طوال فترة التجربة التي استمرت 4 أسابيع .
المجموعة الثانية: (مجموعة فشل المبيض المبكرالمحدث بواسطة السيكلوفوسفاميد ): إشتملت على 10 فأر تم حقنهم مرة واحدة بالسيكلوفوسفاميد 200 مللى جرام / كيلوجرام من وزن الفأر داخل التجويف البريتوني تليها جرعة تنشيط أخرى من السيكلوفوسفاميد 10 مللي جرام / كيلوجرام من وزن الفأر بعد اسبوع واحد من الحقنة الاولى .
المجموعة الثالثة: ( مجموعة العلاج بالخلايا الجذعية المستخلصة من نخاع العظام ): إشتملت على 10 فئران تم حقنهم بالسيكلوفوسفاميد مرة واحدة كما في المجموعة الثانية 200 مللى جرام / كيلوجرام من وزن الفأرتليها جرعة تنشيط من السيكلوفوسفاميد 10 مللى جرام / كيلوجرام من وزن الفأر في الغشاء البريتوني ثم علاجها بالخلايا الجذعية النقية المستخلصة من نخاع العظام بجرعة مقدارها 1x 106 خلية / 100 ميكرولتر مزروعة في الفئران التي تعاني من فشل المبيض من خلال الوريد الذيلي بعد مرور أسبوعين من الحقنة الاولى للسيكلوفوسفاميد .
المجموعة الرابعة: (مجموعة العلاج بالخلايا الجذعية المستخلصة من الحبل السري): إشتملت على 10 فئران تم حقنهم بالسيكلوفوسفاميد مرة واحدة كما في المجموعة الثانية بجرعة 200 مللى جرام/كيلوجرام من وزن الفأرتليها جرعة تنشيط من السيكلوفوسفاميد 10 مللى جرام / كيلوجرام من وزن الفأر في الغشاء البريتوني وثم العلاج بالخلايا الجذعية المستخلصة من الحبل السري بجرعة مقدارها 1x 106 خلية / 100 ميكرولتر مزروعة في الفئران التي تعاني من فشل المبيض من خلال الوريد الذيلي بعد مرور أسبوعين من الحقنة الاولي للسيكلوفوسفاميد .
عينات الدم: في نهاية التجربة بعد 4 أسابيع تم تشريح الفئران في كل مجموعة بعد أسبوع وأسبوعين من العلاج بالخلايا الجذعية النقية ثم جمع عينات الدم أثناء التشريح تحت التخدير وفقا للجهات الأخلاقية لحقوق الحيوانات بواسطة ثقب في القلب فى أنبوبتين أحدهما في أنابيب تحتوي على مادة مانعة للتجلط (EDTA) اثيلين داى أمين رباعي حمض الخليك لتحليل العد الكامل للخلايا الدموية والأخرى في أنابيب فارغة لفصل المصل بإستخدام جهاز الطرد المركزى بسرعة 2500 لفة في الدقيقة وتم حفظها في الديب فريزر في درجة 20 تحت الصفر حتى استخدامها للتحاليل الكيميائيه التالية :تقدير مستوى الهرمونات الأنثوية مثل هرمون اللوتن والهرمون المنبه للحوصلة وهرمون الاستراديول وهرمون تثبيط الموليرين (LH, FSH, E2, AMH) وتقدير مستوى الحديد بالمصل.
عينات الأنسجة: بعد جمع الدم تم الذبح للفئران وفتح البطن وجمع أنسجة المبيض من جميع مجموعات الجرذان ثم تثبيت جزء من أنسجه المبيض في فورمالين بنسبه 10% لمدة 24 ساعه وتضمينها في الشمع وتقسيمها إلي عينات سميكة بسمك 4 مم للتحليل النسيجي بالصبغات الاينوسين والهيماتوكسيلين والصبغة المناعية لبروتين كاسباس 3. كما تم تخزين الانسجة المبيضية المتبقية للفئران وحفظها عند -80 درجة مؤية لحين إستخلاص البروتين والحمض النووي لتقدير موت الخلايا في البويضات من خلال تكسير الحمض النووي. بالأضافة إلى تحليل أنسجة المبيض للقياسات التالية :الاجهاد التأكسدي من خلال تقدير المالون داى ألدهيدMDA) ومضادات الاكسدة مثل أنزيم الكتاليزوقدرة مضادات الأكسدة الكلية والجلوتاثايون المختزل CAT/TAC/GSH)).
وقد أسفرت نتائج هذه الدراسة بعد تحليلها أحصائيا على النحو التالي:
1. التعرف على خلايا الجذعية النقية والتمايز. أظهرت نتائج الفحص التدفقي (FCM) أن خلايا الجذعية النقية تظهر علامات إيجابية للخلايا الجذعية مثلCD44 و Sca-1 و CD29، ولكنها لم تظهر تعبيرًا عن الإشارات السلبية للخلايا الجذعية مثل CD34 و TRE119. تجاوزت نقاء الخلايا المعزولة 98٪. يمكن أن تتطور خلايا الجذعية النقية إلى أنواع مختلفة من الخلايا من الطبقة الوسطى، بما في ذلك الخلايا العظمية، كما يظهر الصبغة بالأليزارين الأحمر وتمايز الخلايا الدهنية كما يوضح الصبغة بـ Oil Red O للتجمعات الخلوية.
2. زراعة الخلايا الجذعية النقية تنظم تعبير هرمونات الجنس في المبيض. تم قياس مستويات هرمونات الجنس في السيروم لجميع الفئران في مجموعات منفصلة بعد أسبوعين من العلاج بالخلايا الجذعية النقية. يسبب CYP انخفاضًا في تركيزات كل من AMH و E2 والتي تحسن بشكل يعتبر إحصائيًا مع العلاج بالخلايا الجذعية النقية تقريبًا إلى المستوى في مجموعة NC. من ناحية أخرى، زيادات ملحوظة إحصائيًا في تركيزات كل من FSH و LH في مجموعة CYP عند المقارنة بمجموعة NC (p<0.0001). تتماثل هذه الزيادة الى الانخفاض مع كل من مجموعات الخلايا الجذعية النقية CYP-UC و CYP-BM إلى مستوى يقارب مستوى مجموعة NC.
3. بعد أسبوعين من علاج الخلايا الجذعية النقية، تحسن مستوى زيادة الحديد في المصل الناتج عن CYP بشكل يعتبر إحصائيًا مع مجموعة NC، تستجيب UC-MSCs بشكل أفضل من BM-MSCs، بشكل خاص بعد أسبوعين من العلاج (P = 0.007).
4. تحسين الاضطرابات الهيماتولوجية الناتجة عن CYP بزراعة الخلايا الجذعية النقية. يسبب CYP سمية هيماتولوجية تحسنت مع العلاج بالخلايا الجذعية النقية وهو ملحوظ بشكل خاص بعد أسبوعين من العلاج. كانت لدى مجموعة CYP عددًا أقل بشكل ملحوظ من الخلايا البيضاء، وتركيز Hb، ونسبة HCT٪، وعدد الصفائح الدموية مقارنة بمجموعة NC (P<0.0001). علاج الخلايا الجذعية النقية يعمل على تحسين هذه الانخفاضات، بشكل خاص بعد أسبوعين (P<0.0001). بعد أسبوع واحد من العلاج، تستجيب مجموعة UC-MSCs بشكل أفضل من مجموعة BM-MSCs بشكل خاص في عدد الخلايا البيضاء؛ P=0.001). كانت لدى مجموعة CYP عددًا أقل بشكل ملحوظ من الكريات الحمراء، وحجم الخلية المعبأة (PCV)، وبالتالي MCV، MCH، و MCHC مقارنة بمجموعة NC (P<0.0001). يقوم العلاج بالخلايا الجذعية النقية بإعادة تشكيل هذه الانخفاضات، بشكل خاص بعد أسبوعين (P<0.0001). تستجيب BM-MSCs أو UC-MSCs بشكل مماثل لمجموعة NC، بشكل خاص بعد أسبوعين من العلاج.
5. زراعة الخلايا الجذعية النقية تحسن الهيكل المبيضي للجرذان الإناث. بعد أربعة عشر يومًا من التصميم/الحقن، فحصنا تشريح المبيض باستخدام صبغة H&E وعدنا جميع البويضات في أربع مجموعات من الفئران على التوالي. لاحظنا انخفاضًا ملحوظًا في كمية المراحل البويضية المميزة في مجموعة CYP مقارنة بمجموعة NC (p<0.001). استعاد متوسط عدد البويضات بعد زراعة الخلايا الجذعية النقية في كل من مجموعات CYP-UC و CYP-BM مقارنة بمجموعة CYP (p<0.0001)، على الرغم من عدم وصوله إلى مستوى مجموعة NC (p<0.0001). تشير هذه النتائج إلى أن زراعة الخلايا الجذعية النقية قد تعيد جزئيًا هيكل المبيض. المتمثل فى عدد البويضات المتدهورة أكبر في مجموعة CYP من مجموعة NC. تم استعادة هذه البويضات إلى المستوى الملاحظ في مجموعة NC بعد علاج الخلايا الجذعية النقية (p<0.0001).
6. النتائج من أقسام المبيض الملونة بالمضادات المناعية مع كاسبيز-3. أظهرت مجموعة NC عدم وجود تفاعل مناعي تجاه كاسبيز-3 في الأنسجة الشبكية، وخلايا الظهارة، والبويضات الغرافية. أظهرت مجموعة CYP بويضات غرافية مع ردود مناعية إيجابية قوية في الخلايا الظهارية والشبكية و صبغة إيجابي واسع مع البويضات الغرافية والشبكية. أظهرت المجموعة التي تلقت الخلايا الجذعية بويضات غرافية، تتميز بوجود بعض الصبغات المناعية الإيجابية في الخلايا الظهارية والشبكية، بينما عرضت البويضات والشبكية الصبغات إيجابية خافتة.
7. المعايير الكيميائية للمبيض. تم قياس مستوى الأكسدة مثل MDA ومستوى الأنزيمات المضادة للأكسدة مثل GSH وATC ونشاط CAT في جميع المجموعات المختبرة. يظهر الضرر المبيضي الناتج عن CYP زيادة في مستويات MDA وانخفاض في مستويات GSH و TAC، ونشاط CAT مقارنة بالمجموعة الضابطة (P<0.0001). تم ملاحظة انخفاض كبير في مستوى MDA وارتفاع في مستويات GSH و TAC ونشاط CAT في الأنسجة المبيضية للحيوانات المعالجة بكل من الخلايا الجذعية النقية مقارنة بمجموعة السيطرة الإيجابية CYP (P<0.0001).
8. قياس تكسير الحمض النووى في المبيض لقياس الموت المبرمج للخلايا. تم الكشف السريع عن سلم الـ DNA في الأنسجة المبيضية. يحسن تأثير العلاج بالخلايا الجذعية تكسير الحمض النووى المحدثة بواسطة CYP في الفئران الإناث بشكل مماثل للمجموعة الضابطة.
الخلاصة
خلصت الدراسة أن حقن عقارالسيكلوفوسفاميد له تأثير ضارعلي المكونات الحيوية لخلايا وأنسجة المبيض ويمكن أن يضر وظيفة المبيض ويعطل إفراز الهرمونات التناسلية. وأن فشل المبيض المبكر بعقار السيكلوفوسفاميد له تأثير ضار أيضاعلى عدد البويضات في المبيض وعلي مستوي الهرمونات الأنثوية والحديد في مصل الفئران والذى يرجع أساسا إلى فشل وظيفة المبيض وان العلاج بالخلايا الجذعية المزنشيمية المستخلصة من نخاع العظام والحبل السري كان لها دورا فعالاً فى تحسين مستوي الهرمونات الأنثوية الجنسية في المبيض وتحسين مستوى الحديد في المصل وتحسين الاضطرابات في تحليل مكونات صورة الدم وتقليل الأجهاد التأكسدى وتحسين مستوى مضادات الأكسدة للفئران المحدث فيها فشل المبيض تجريبيا بالسيكلوفوسفاميد لتعود إلي المعدل الطبيعي بالإضافة لدورالخلايا الجزعية في تحسين الهيكل المبيضي لإناث الفئران وأيضا تأثيرالخلايا الجذعية على تحسين تكسير الحمض النووي بشكل مماثل للمجموعة الضابطة ويستنتج من ذلك أهمية دور الخلايا الجذعية في علاج ضعف الخصوبة الناجم عن العلاج الكيميائي.
لذلك توصي الدراسة باستخدام تقنية زراعة الخلايا الجذعية الميزنشيمية كإستيراتيجية مفيدة في التجارب السريرية المستقبلية وذلك لتسهيل إعادة فشل المبيض المبكرمن خلال تعزيز إفراز الهرمونات التناسلية .