الفهرس 
GAS chrOMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY (GC/MS) ANALYSIS OF THE STUDIED ESSENTIAL OILSOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 139 |  |  |
| | | from | 139 | | |
Abstract
يلعب النحل دورًا مهماً في تلقيح العديد من النباتات المختلفة، مما يساهم بشكل كبير في تنمية الثروة النباتية. كما أنه ينتج عسل النحل والذي يعتبر من أهم الأطعمة الطبيعية التي تتميز بالعديد من الفوائد الغذائية، فضلاً عن العديد من الفوائد الصحية للإنسان وتقوية المناعة ومقاومة العديد من الأمراض. لذلك فإن الأمراض التي تصيب النحل تمثل تحديات كبيرة في مجال الزراعة بشكل عام وفي مجال النحل بشكل خاص.
تعتبر أمراض تعفن الحضنة الأمريكي والأوروبي من أكثر الأمراض التي تصيب النحل وتدمر خلاياه. لذلك فإن البحث عن طرق بيولوجية جديدة لمقاومة مثل هذه الأمراض له أهمية كبيرة في القطاع الزراعي المصري دون اللجوء إلى استخدام المضادات الحيوية. ولذلك فإن هدف هذه الدراسة لتثبيط نشاط بكتريا الـ Paenibacillus larvae العامل المسبب لـمرض تعفن الحضنة الأمريكي تم عمل ما يلي:
1) تم اختيار أربع زيوت عطرية هي الزيوت العطرية لكلاً من الريحان، والزعتر، وحشيشة الليمون، والنعناع وعمل تحليل GC-MS لمعرفة أهم المكونات الكيميائية لهذه الزيوت والتي كانت كالتالي:
- أظهرت نتائج التحليل أن الزيت العطري للريحان احتوي على 13 مكون وأهم هذه المكونات مركب الـ L-linalool والذي يمثل (59.02٪)، والـ 1,8- Cineole والذي يمثل (9.52٪)، والـ α-Cadinol والذي يمثل (6.59٪)، والـ α-Bergamotene والذي يمثل (5.74٪)، بينما الزيت العطري للزعتر احتوي على 10 مكونات وأهم هذه المكونات مركب الـ Thymol والذي يمثل (48.06٪)، والـ p-Cymene والذي يمثل (38.57٪)، والـ Caryophyllene والذي يمثل (8.27٪)، والـ L-linalool والذي يمثل (1.90٪)، والزيت العطري لحشيشة الليمون احتوي على 23 مكون وأهم هذه المكونات مركب الـ Geranial والذي يمثل (47.59٪)، والـ Neral والذي يمثل (36.27٪)، والـ β-Myrcene والذي يمثل (7.57٪)، والـ Geraniol والذي يمثل (1.5٪)، في حين أن الزيت العطري للنعناع احتوي على 14 مكون وأهم هذه المكونات مركب الـ Menthol والذي يمثل (40.44٪)، والـ p-Menthone والذي يمثل (10.93٪)، والـ L-menthone والذي يمثل (7.64٪)، والـ 1,8- Cineole والذي يمثل (7.35٪)، والـ Dehydrodieugenol والذي يمثل (5.72٪)، والـ D-limonene والذي يمثل (5.39٪).
2) تقييم النشاط المضاد للأكسدة للزيوت معملياً باستخدام طريقتي الـ FRAP والـ DPPH بعد تقدير المحتوي الكلي للمركبات الفينولية في هذه الزيوت العطرية كمكافئات لحامض الجاليك (μGAE/mg) والتي تتلخص فيما يلي:
- بينت نتائج التقدير أن الزيت العطري للريحان احتوي على أعلي كمية من المركبات الفينولية الكلية والتي بلغت كميتها (μg/mg 74.06)، يليه الزيت العطري للنعناع (μg/mg 22.51)، ثم الزيت العطري للزعتر (μg/mg 8.1)، واخيراً الزيت العطري لحشيشة الليمون (μg/mg 5.95).
- أظهرت نتائج طريقة الـ FRAP والتي تعتمد على قياس قوة مضادات الأكسدة عن طريق إختزال أيون الحديديك (Fe+3) وتحويله إلى أيون حديديوز (Fe+2) أن الزيت العطري للريحان سجل أعلي قيمة والتي تمثل (2.35± 0.61 mMol Fe+2/g)، يليه الزيت العطري للنعناع بقيمة تصل إلى (2.17± 0.35 mMol Fe+2/g)، ثم الزيت العطري للزعتر (1.96± 0.42 mMol Fe+2/g)، واخيراً الزيت العطري لحشيشة الليمون (0.93± 0.21 mMol Fe+2/g) وعلى الجانب الأخر أظهر مخلوط الزيوت الأربعة قيمة تصل إلي (1.98± 0.54 mMol Fe+2/g)
- كما أظهرت نتائج طريقة الـ DPPH والتي تعتمد على قياس قوة مضادات الأكسدة عن طريق قدرتها على نقل الإلكترونات أو ذرات الهيدروجين إلى الـ DPPH وبالتالي قدرتها علي إزالة الشقوق الحرة أن الـ IC50 للزيت العطري للريحان سجل أقل قيمة والتي تمثل (144.78 ± 7.19 μg/ml)، يليه الزيت العطري للزعتر بقيمة تصل إلي (183.45 ± 7.19 μg/ml)، ثم الزيت العطري للنعناع بقيمة ( 170.05 ± 6.97 μg/ml)، واخيراً الزيت العطري لحشيشة الليمون بقيمة ( 802.27 ± 24.18 μg/ml )، وعلي الجانب الأخر أظهر مخلوط الزيوت الأربعة قيمة ( 589.15 ± 21.34μg/ml )
3) تقييم النشاط المضاد للميكروبات لهذه الزيوت المستخدمة وتم ذلك عن طريق:
⮚ عزل البكتيريا من الحضنة والتعرف عليها:
تم عزل 13 عزلة بكتيرية من يرقات نحل العسل المصابة في بيئة الأجار ووجد أنها تختلف عن بعضها من حيث الشكل بين الكروية والقصيرة ، كما أن بعضها كان موجب لصبغة جرام والأخر سالب.
⮚ دراسة تأثير الزيوت العطرية لكلاً من الريحان، والزعتر، وحشيشة الليمون، والنعناع على الـ 13 عزلة:
- أعطي الزيت العطري للريحان نشاط ميكروبي ضد العزلات المختلفة وكان أعلي تثبيط ضد العزلات رقم 11 و 12 ثم رقم 2 وأخيراً العزلات رقم 4 و 7 و 13 علي الترتيب، بينما أعطي الزيت العطري للزعتر أعلي تثبيط ضد العزلات رقم 9 و 2 ثم رقم 1 و 8 و 12 علي الترتيب، والزيت العطري للنعناع أعلي تثبيط ضد العزلات رقم 8 و9 ثم رقم 1 و 2 ثم العزلات رقم 7 و 12 و 13 علي الترتيب، في حين الزيت العطري لحشيشة الليمون أظهر أضعف تأثير بشكل عام على جميع العزلات مقارنة بباقي الزيوت العطرية المستخدمة في التجربة كما أنه أعطي أعلى تثبيط ضد العزلات رقم 7 و 12 و 13 ثم العزلات رقم 4 و 8 و 1 علي الترتيب.
4) التجربة الحقلية:
⮚ أظهرت نتائج الإصابة بالعزلات المختلفة أن هناك عزلتين فقط تسببتا في اظهار نفس الأعراض المرضية المختلفة لحضنة النحل في الخلية وسميت بـ M1 و M2، وللتعرف أكثر علي هاتين العزلتين تم عمل تحليلات بيولوجية للجين 16S rRNA ودراسات حقلية كمضادات ميكروبية والتي من خلالها:
- أوضح تحليل التتابع الجزئي للجين 16S rRNA من العزلات أن العزلة البكتيرية ليرقات Paenibacillus larvae X and P أظهرت ارتباطًا وثيقًا بنسبة تماثل 99.90٪ مع كلا السلالتين PL 35 و PL 324، بينما كانت نسبة التماثل 99.66٪، 98.80٪، 98.79٪، 98.44٪، 98.40٪، 98.39٪، 98.36٪، 98.18٪ مع سلالات الـPL رقم 9 ، 87 ، 38 ، 12 ، 17 ، 96 ، 76 ، 34 على التوالي.
- معاملة طائفة النحل المصابة بجراثيم الـ Bacillus (بــ 100 µl من الـ Bacillus M1) بخليط الزيوت العطرية أدي إلى زيادة في مناطق الحضنة تليها مجموعة الزيت العطري لحشيشة الليمون ومجموعة الزيت العطري للنعناع وتم تقليل جميع المعاملات.
- معاملة طائفة النحل المصابة بجراثيم الـ Bacillus (بــ 100 µl من الـ Bacillus M2) بخليط الزيوت العطرية أدي إلى زيادة في مناطق الحضنة، كما تناقصت جميع المعاملات مع السلالة الثانية من الـ Bacillus.
- معاملة طائفة النحل المصابة بجراثيم الـ Bacillus (بــ 150 µl من الـ Bacillus M1) بخليط الزيوت العطرية أدي إلى زيادة في مناطق الحضنة ثم الطائفة المعاملة بالزيت العطري لحشيشة الليمون وفي فترات متأخرة من المعاملة أظهر الزيت العطري للنعناع زيادة معنوية وتم تقليل جميع المعاملات الأخرى.
- معاملة طائفة النحل المصابة بجراثيم الـ Bacillus (بــ 150 µl من الـ Bacillus M2) بخليط الزيوت العطرية أدي إلى زيادة في مناطق الحضنة في حين تناقصت جميع المعاملات الأخرى.
- معاملة طائفة النحل المصابة بجراثيم الـ Bacillus (بــ 100 µl من M1 + M2) بخليط الزيوت العطرية أدي إلى زيادة في مناطق الحضنة ثم الطائفة المعاملة بالزيت العطري للنعناع في حين تم تقليل جميع المعاملات الأخرى.
- معاملة طائفة النحل المصابة بجراثيم الـ Bacillus (بــ 150 µl من M1 + M2) بخليط الزيوت العطرية أدي إلى زيادة في مناطق الحضنة ثم الطائفة المعاملة بالزيت العطري لحشيشة الليمون في حين تم تقليل جميع المعاملات الأخرى.
5) التعرف على المستقبلات العلاجية الحديثة للمسبب الرئيسي لمرض تعفن الحضنة الامريكي لنحل العسل
- تم تنفيذ بروتوكول لقاح عكسي على بروتين P. larvae. بروتينات اليرقات (26603 بروتين) للعثور على أهداف دوائية محتملة تنتهي بثلاثة مرشحين محتملين يمكن وصفهم على أنهم عوامل أساسية ، غير متماثلة ، خبيثة ، بروتينات غشاء هيولي أو حشوي..
أخيرًا يمكننا القول أن الزيوت العطريه المختبرة (الريحان والزعتر والنعناع وحشيشة الليمون) هي عوامل واعدة ضد P. larvae. في المستقبل القريب، نهدف إلى فحص مكتبات المركبات النشطة بيولوجيًا مقابل الأهداف الثلاثة المحتملة لهذه المضادات الميكروبية في P. larvae باستخدام الالتحام الجزيئي لمعالجة الآثار الضارة لهذا العامل الممرض.