الفهرس 
INTRODUCTIONOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 107 |  |  |
| | | from | 107 | | |
Abstract
اجريت هذه الدراسه فى معامل مركز الهندسه الوراثيه والتكنولوجيا الحيويه كليه الزراعه جامعه عين شمس .
ينمو الطلب العالمى على الانزيمات الصناعيه بشكل كبيرسنويا. حيث انها تدخل فى العديد من الصناعات مثل انتاج الادويه، تحسين جوده الوقود الحيوي، انتاج الاعلاف و الصناعات الغذائيه. تنوعت طرق انتاج الانزيمات ومصادرها حيث ان ما يقرب من 60% من الانزيمات الصناعيه يتم انتاجها بواسطه الفطريات. اكثر الانزيمات الصناعيه اهميه هما الاميليز والبروتييز. حيث انهم يمثلوا اكثر من 90% من سوق الانزيمات العالمى يليهم اهميه انزيم الليبيز.
ونظرا لاهميه هذه الانزيمات تم التخطيط لهذه الدراسه لانتاج الانزيمات من الفطريات تم عزل عدد من الفطريات من التربه من منطقه وادى النطرون محافظه البحيره وتم الحصول على 14 عزله متباينه فى الاشكال المظهريه وعند تعريفها وجد ان 10 منهم (A.N) Aspergillus niger واخذت ارقام من1 الى 10 ،واربعه عزلات Aspergillus terreus (A.T) واخذت ارقام من 1 الى 4 .
ولقياس قدرتها على انتاج الانزيمات تم اختبار قدره هذه العزلات على انتاج :
1- انزيم الليبيز ويعمل على تكسير الدهون لإنتاج الأحماض الدهنية الحرة والجلسرين.حيث ان له أهمية كبيرة في مجال التكنولوجيا الحيوية نظرًا لتعدد استخداماتها فى الصناعات الغذائية ،الكيميائية ،المنسوجات ،الأدوية ومستحضرات التجميل.
2- انزيم الاميليز وهو انزيم يعمل على تحليل الروابط المتواجده فى النشا يمثل نسبه 30% من اجمالى انتاج الانزيمات عالميا . حيث يشارك فى انتاج الايثانول، صناعه المنسوجات، الورق والمنظفات.
3- انزيم البروتييزيعمل على تحليل البروتينات وتحويلها الى احماض امينيه و يمثل أكثر من 60٪ من إجمالي مبيعات الإنزيمات الصناعية في العالم. له استخدامات عديده فى صناعات الالبان والمنظفات.
وعند تقدير نشاط العزلات الممثله فى قدره انتاجها وضح ان عند تقدير نشاط الليبيزعزلات A.N رقم A.N3(0.73U\ml) ,A.N9 (0.79U\ml) ,A.N10 (0.91U\ml) كانوا الاكثر نشاطا ، اما عزلات الـ A.T فكان A.T1(0.87U\ml),A.T3(0.92U\ml) الاكثر نشاطا.
وعند حساب نشاط انزيم الاميليزاتضح ان العزلاتA.N1(1.16U\ml)و A.N10(1.16U\ml) هم الاكثر نشاطا من عزلات ال A.N,وعند اختبار عزلات ال A.T وجد ان A.T2(0.90U\ml)و A.T3 (0.99U\ml) افضل العزلات انتاجا.
عند تقدير البروتييز وجد ان عزلات ال A.N رقمA.N7(0.91U\ml), A.N8(1.07U\ml), A.N10(1.11U\ml) اكثر العزلات نشاطا ومن ال A.T وجد ان A.T4 اكثر العزلات انتاجا( 0.48U\ml).
وبعد تقدير هذه الانزيمات وتحديد قدرتها الانتاجيه زنظرا لقياس العزلات تم الدخول على المرحله التاليه من الدراسه وهى التحسين الوراثى للعزلات لزياده قدرتها الانتاجيه
التحسين الوراثى :
بعد التعرف على قدره العلات المعرفه فى انتاج انزيمات الليبيز،الاميليز والبروتييزوجد ان افضل العزلات هى A.N10 من Aspergillus niger و A.T3 من عزلات Aspergillus terreus حيث تتميز هذه العزلات بأفضل انتاج من العزلات المطروحه.
تم الاعتماد على استخدام الاشعه الفوق بنفسيجيه لاستحداث طفرات من هذه السلالات اعتمادا على العديد من المراجع التى فضلت استخدام الاشعه الفوق بنفسيجيه فى تحسين هذه الصفات.ولاجراء ذلك تم تعريض العزلات المختاره A.N10 و A.T3لطول موجى λ=253 nm و 220 V مع مسافه سم لوقت زمني من 5-40 دقيقه. وبعد ذلك تم الحصول على 50 طفره من كل عزله .
عند تقدير الليبيز مع العزلات المطفره من A.terreus كانت الزياده القصوى فى الطفره U\ml) 1.83 ( M.T15 ،اما فى عزله A.niger سجله الطفره M.N49(1.42U\ml) .
الاميليز كانت الطفره M.N30 اكثرهم زياده فى الانتاج بنسبه 1.41 بالمقارنه بالعزله الام 0.96 ، والطفره M.T15 بنسبه 1.83 افضل العزلات المطفره من عزله ال A.terreus .
وبالنسبه لانزيم البروتييز اظهر نسبه اقل فى الانتاج بعد تعرضه للاشعه الفوق بنفسجيه ،عند مقارنه العزله الام فى ال A.niger بنسبه 1.106 باعلى عزله تعرضت للمطفر M.N30 بنسبه 0.66 تم ملاحظه تناقص فى النشاط ،وكذلك A.terreus تناقص نشاط الانزيم بشكل ملحوظ.
دراسه الاختلافات الوراثيه
بعد قياس قدره الطفرات الجديده وزياده قدرتها على الانتاج للانزيمات ، يتطلب الكشف عن مدى تشابهه الطفرات مع العزلات الاصليه ولقياس مدى التشابهه والاختلافات، تم الاعتماد على تقنيه ال RAPD حيث انها تقنيه متميزه لدراسة التباين والارتباط بين الأنواع، وتعتبر تقنيه كافيه لتمييز الاختلافات بين العزلات الاصليه والعزلات المطفره.
وبعد تطبيق تلك التقنيه كانت النتائج كالتالى تم عمل تقنيه RAPD لعزله Aspergillus niger وأفضل 4 طفرات منتجه للانزيمات ، حيث وجد جميع البرايمر الستة 61.22% من تعدد الأشكال المظهريه وسجلت أعلى نسبة تعدد فى الاختلافات على التوالي 80% و75% بواسطة برايمر OP-C15 وOP-D1 ،.تم عرض أعلى نسبة من monomorphism بنسب متساوية في OP-C15 و OP-D1. تم تسجيل أقل نسبة مئوية من تعدد الأشكال بواسطة البرايمر OP-D9 ، ولكن في أحادي الشكل تم تسجيله بواسطه OP- D9وOP-K2.
تم عمل تعريف RAPD الجزيئي لعزل Aspergillus terreus وأفضل 4 طفرات ناتجة مختلفة ، حيث وجدت برايمر ال RAPD الستة 48.88٪ من تعدد الأشكال وسجلت أعلى نسبة تعدد الأشكال 85.71٪ و 71.42٪ بواسطة البرايمر OP-D1 و OP-K2 ، على التوالي. . تم عرض أعلى نسبة من monomorphism بنسب متساوية في OP-C9 و OP-C15 و OP-D9. تم تسجيل أقل نسبة مئوية من تعدد الأشكال بواسطة البرايمر OP-C9 ، ولكن في أحادي الشكل تم تسجيله بواسطة OP-D1. تم إنشاء أكبر عدد من الاشكال المظهريه بواسطة OP-C3 و OP-D9 ، بينما تم إنشاء أقل عدد من الاشكال المظهريه بواسطة البرايمر