الفهرس 
HAIROnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 120 |  |  |
| | | from | 120 | | |
Abstract
يعد استخدام مثيلية الحمض النووي (DNAm) للحصول على معلومات في تحقيقات الطب الشرعي أنه مجال اهتمام واعد ومتزايد. لفترة طويلة ، كان مثيلية الحمض النووي (DNAm) ”بقعة سوداء” لعلماء الطب الشرعي. على مر السنين, من المعترف به أن تحليل الحمض النووي يمكن أن يعطي معلومات جنائية إضافية ذات صلة بالتوازي مع صورة الحمض النووي.
ينطوي مثيلية الحمض النووي على إضافة مجموعة الميثيل إلى السيتوزين 5 ’C من ثنائي النوكليوتيدات CG ، والمشار إليه باسم CpGs.
في الجينوم البشري ، يتم تكوين ميثيل 70-80 ٪ من مجموع CpG ويتم تجميع معظم CpG غير المصنوع في CpG في نهاية 5 ’من الجينات.
في السنوات الأخيرة ، تم تحديد المواقع التي تعتمد على العمر الوراثي في دراسات متعددة وتم تطويرها لأغراض الطب الشرعي للتنبؤ بعمر الفرد كدليل استقصائي.
يختلف العمر الزمني ، حسب الوقت المنقضي منذ الولادة ، عن العمر البيولوجي ، وهو مقياس لعملية الشيخوخة في الفرد المرتبط إلى متوسط العمر المتوقع ويتأثر بعوامل مستقلة عن مرور الوقت وحده. فالشيخوخة هي عملية طبيعية وتدريجية في حياة الإنسان تتأثر بالوراثة والبيئة وأسلوب الحياة والمرض.
يتفاوت ميثلة الحمض النووي مع التقادم والتفاوت الجيني والتعرض البيئي مثل الحمية والتدخين وأشعة الشمس والأشعة فوق البنفسجية والعدوى الممرضة والتمارين واستهلاك الكحول والضغط والقدرة على التنبؤ بعمر المتبرع باستخدام الحمض النووي من مواد الأدلة في مسرح الجريمة مما يجعلها ذات قيمة كبيرة في التحقيقات الجنائية.
تتغيرمثيلية الحمض النووى مع العمر داخل كل فرد ويظهر أنه يحدث في مواقع محددة من CpG في جميع الأفراد ولكن مع اختلافات فردية في ”السرعة” ، تظهر اختلافات أكثر في الحمض النووي في المسنين والتوائم مقارنة مع الشباب, وقد وصفت العلاقة بين مثيلة الحمض النووي والشيخوخة بأنها الانجراف اللاجينية والساعة اللاجينية. يزيد الانجراف الوراثي اللاجيني من الاختلاف بين الأفراد مع العمر المتأثر بالعوامل البيئية. في المقابل ، يرتبط ارتباطا وثيقا على مدار الساعة مواقع جينية مع العمر عبر الأفراد ، وبالتالي يمكن استخدامها للتنبؤ العمر الزمني.
تتباين دقة التنبؤ بالعمر حسب نوع النسيج. في مجال الطب الشرعي ، ظهرت نماذج للتنبؤ بالعمر في الدم واللعاب والسائل المنوي ومسحات الشدق والأسنان باستخدام عدد قليل فقط من CpGs المرتبطة بالعمر.
الهدف من الدراسة
◙ الهدف من دراستنا هو تقييم فائدة استخدام مثيلة الحمض النووي لمواقع 7CpG من جين ELOVL2 في التنبؤ بالعمر الجنائي ، ومقارنة دقتها في عينات بيولوجية مختلفة (الدم واللعاب والأسنان والشعر) وإمكانية تطبيقها على السكان المصريين والتي لم يتم استكشافها من قبل.
استخدمنا نماذج التنبؤ العمرية Zbiec-Piekarska1 المنشورة بالفعل والتي تضم موقعين من مواقع CpG لجين ELOVL2 لتقدير العمر لعينات الدم والشعر واللعاب والأسنان. حتى الآن ، لم يتم تقييم هذا النموذج للتنبؤ بالعمر المستند إلى الدم سوى عدد قليل من الدراسات ، ولم تقم أي دراسة بتقييم هذا النموذج على السكان المصريين أو على أنواع عينات أخرى.
لتطوير نماذج الانحدار الخطي للتنبؤ بالعمر مع عدد قليل من CpGs لعينات الدم والشعر واللعاب والأسنان باستخدام تقنية التسلسل الحراري.
الحالات وطرق البحث
الحالات:
أجريت الدراسة الحالية على 80 متطوعًا سليمًا من غير الأقارب من كلا الجنسين الذين قدموا إلى عيادة الأسنان بمستشفى بنها الجامعي بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة موقعة من كل مشارك فيما يتعلق بالاجراءات التي يتعين إجراؤها وجمع العينات قبل تسجيلهم في الدراسة. تراوحت أعمار المتطوعين من 18 إلى 69 عامًا وتم تصنيفها إلى 4 مجموعات على النحو التالي:
المجموعة (1): 18 - 29 سنة.
المجموعة (2): 30 - 39 سنة.
المجموعة (3): 40 - 49 سنة.
المجموعة (4): 50 - 69 سنة.
طرق البحث:
1 - جمع العينات:
• الدم: تم الحصول على 5 مل من عينات الدم الوريدي الطرفى من كل حالة تحت ظروف معقمة كاملة وتم جمعها في أنابيب شاغرة تحتوي على EDTA من أجل تخزينها في -80 درجة مئوية لمزيد من الفحص الجزيئي.
• اللعاب:
تم جمع عينات اللعاب من كل فرد باستخدام أنابيب بلاستيكية. ثم تخزين جميع العينات على الفور في الثلاجة −30 درجة مئوية حتى الاستخدام.
• الأسنان:
تم جمع 80 سن من المرضى من عيادات الاسنان التابعة لمستشفى بنها الجامعى.، ثم غسل الأسنان باستخدام فرشاة أسنان ناعمة تحت الماء المقطر الجاري. بعد ذلك ، تم تشعيع الأسنان بالأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) لمدة 15 دقيقة في كل جانب لإزالة الحمض النووي الخارجي ، ومن ثم تم عزل العاج من الأسنان.
• الشعر:
تم جمع عينات الشعر وفحصها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2- استخلاص الحمض النووي:
تم استخلاص الحمض النووي من 200 إلى 400 ميكرولتر من الدم باستخدام مجموعات مناسبة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم قياس كمية الحمض النووي باستخدام تقنية النانو.
3- تحويل ثنائى السلفات باستخدام مجموعات مناسبة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
4- زيادة كمية الحمض النووي باستخدام التفاعل المتسلسل للبلمرة.
5- استخدام الفصل الكهربائي للهلامى للتحقق من جودة منتجات التضخيم amplicons لكل فرد.
6- فحص تسلسل الحمض النووي الديوكسي ريبوزى: تم فحص تسلسل بركة الحمض النووي النهائي.
7- تحليل البيانات:
تم استخدام حزمة الإحصاءات للعلوم الاجتماعية (SPSS) لمعالجة البيانات وتحليل البيانات.
وقد اظهرت الدراسه ما يلى:
(1) قدم النموذج أفضل أداء في تحديد العمر بناءً على عينات اللعاب (MAD = 0.7 ، SEE = 0.0 ، PCP = 99) ، ثم عينات الدم والأسنان (MAD = 2.5 ، SEE = 0.1 ، PCP = 93) لكليهما. كانت أفضل عينة مرتبطة بالعمر هي اللعاب ، حيث استمر زيادتها في خط مستقيم ولكن أظهرت عينات أخرى من الدم والشعر والأسنان ثبات نسب النتائج فوق 50 عامًا.
(2) كان أفضل أداء للنموذج في الفئة العمرية الثالثة (40-49) في جميع العينات ، بينما لوحظ أسوأ أداء في الفئة العمرية الرابعة (50 - 59) لكبار السن في جميع العينات باستثناء اللعاب.
(3) لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين العمر الزمني والعمر التقديري في جميع الفئات العمرية وجميع العينات.
(4) كانت هناك علاقة ارتباط ذات دلالة إحصائية بين حالة الحمض النووي في مواقع CpG للجين ELOVL2 والعمر الزمني في جميع العينات المدروسة.
(5) بالنسبة لعينات الدم ، تم تمثيل أعلى حالة مثيلية في CpG1 ، ثم CpG4 ، وتم تمثيل أدنى حالة مثيلية في CpG6.
(6) بالنسبة لعينات الشعر ، تم تمثيل أعلى حالة مثيلية في CpG1 ، ثم CpG4 ، وتم تمثيل أدنى حالة مثيلية في CpG7.
(7) بالنسبة لعينات اللعاب ، تم تمثيل أعلى حالة مثيلية في CpG1 ، ثم CpG4 ، وتم تمثيل أدنى حالة مثيلية في CpG7.
(8) بالنسبة لعينات الأسنان ، تم تمثيل أعلى حالة مثيلية في CpG1 ، ثم CpG4 ، وتم تمثيل أقل حالة مثيلية في CpG7.
(9) فيما يتعلق بنموذج التنبؤ بالدم ، CpG2 و CpG5 في ELOVL2 (المعدلة R2 = 0.95) ، 6.4٪ من متوسط النسبة المئوية المطلقة للخطأ بمتوسط خطأ RMSE يبلغ 3 سنوات. كان MAD 2.2 سنة. تم حساب العمر المتوقع = -38.9 + 0.7CpG2 + 0.9 CpG5
(10) فيما يتعلق بنموذج التنبؤ بالشعر ، كانت CpG5 و CpG6 و CpG7 هي الأكثر استخدامًا لمعادلة التنبؤ. تم أخذها في الاعتبار لمعادلة التنبؤ النهائية (R2 المعدلة = 0.97) مع خطأ تنبؤ RMSE يبلغ 2.1 سنة و MAD 1.6سنة. تم حساب العمر المتوقع = -20.5 + 0.3 +CpG5 0.5 + 0.2+ CpG6 0.5CpG7 . قدم هذا النموذج أداءً عامًا جيدًا للتنبؤ بالعمر مع MAPE 5%.
(11) فيما يتعلق بنموذج التنبؤ باللعاب ، كانت CpG2 و CpG4 و CpG5 هي الأكثر استخدامًا لمعادلة التنبؤ. تم أخذها في الاعتبار لمعادلة التنبؤ النهائية (R2 المعدلة = 0.99) مع خطأ تنبؤ RMSE يبلغ 1.5 سنة و MAD 1.2سنة. تم حساب العمر المتوقع = -47.8 + 0.5 + CpG2 0.4 + 0.4 + CpG4 0.4 CpG5 . قدم هذا النموذج أداءً عامًا جيدًا للتنبؤ بالعمر مع MAPE 4%.
(12) فيما يتعلق بنموذج تنبؤ الأسنان ، كان CpG2 و CpG5 الأكثر استخدامًا لمعادلة التنبؤ. تم أخذها في الاعتبار لمعادلة التنبؤ النهائية (R2 المعدلة = 0.97) مع خطأ تنبؤ RMSE يبلغ 2.3 سنة و MAD 1.8سنة. تم حساب العمر المتوقع = -28.2 + 0.8CpG2 + 0.3CpG5. قدم هذا النموذج أداءً عامًا جيدًا للتنبؤ بالعمر مع MAPE ، 5.4 ٪.
(13) كان اللعاب يحتوي على أدنى نسبة (4٪) في حين أن الدم كان أعلى نسبة (6.4٪). تم حساب أقل قيمة MAD (1.2) للعاب وأعلى قيمة (2.2) لعينة الدم.
(14) كان للجنس تأثير غير معنوي على تقدير العمر باستخدام مثيلة الحمض النووي لجين ELOVL2 في جميع المواقع وجميع أنواع العينات (عينات الدم واللعاب والأسنان والشعر).
التــوصيــــــات
1)أهمية إتاحة قاعدة بيانات لمسحات الحمض النووي لمقارنة المشتبه بهم ؛ ومع ذلك ، في العديد من البلدان لا توجد قاعدة بيانات ، وحيثما وجدت ، فإنها عادة ما تكون غير كاملة. هذا هو السبب في استخدام التقنيات الجزيئية كعلامات فوق جينية لتوفير المعلومات للمساعدة في حل قضايا الطب الشرعي.
2)لا يمكن أن يعتمد تحليل التنبؤ بالعمر بشكل كامل على النتائج التي تم الحصول عليها من الدراسات السابقة ، حيث تتعرض المجموعات السكانية لعوامل بيئية مختلفة يمكن أن تغير تنظيم الجينات وبالتالي أنماط المثيلية. يجب تسلسل كل مجموعة سكانية وتحليلها ليس فقط لتوحيد التقنية ، ولكن أيضًا المعايير المرجعية المستخدمة في تفسير النتائج.
3)يجب إجراء تقييم منهجي لنماذج التنبؤ العمرية المختلفة على نفس السكان من أجل مقارنة أدائهم وتحديد النموذج بأفضل دقة تنبؤ بالعمر.
4)لا ينبغي تطبيق نموذج تقدير العمر باستخدام الحمض النووي للدم مباشرة على عينات اللعاب والأسنان والشعر.
5)معرفة المواقع اللاجينية المناسبة لسائل جسم معين سيكون أمرًا بالغ الأهمية بشكل خاص في تطبيقات الطب الشرعي حيث يمكن استخدام تحديد العمر اللاجيني في محاولة لتحديد أو التمييز بين المشتبه بهم المحتملين في القضايا الجنائية.
6)هناك حاجة إلى مزيد من العمل ، بما في ذلك أحجام العينات الكبيرة ، وسوائل الجسم الأخرى ، وتجنيد تنبؤات إضافية ، موجودة بشكل خاص في جينات مختلفة.
7)نشر نماذجنا للتنبؤ بالعمر المستمدة من هذه الرسالة إلى هيئة الطب الشرعي ومكاتب الطب الشرعي لاستخدامها في المستقبل في تقدير العمر.