الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 178 |  |  |
| | | from | 178 | | |
Abstract
اكتشاف الاستشعار العددي للبكتيريا أدى إلى فتح طرق جديدة لمكافحة العدوى المسببة من البكتيريا الممرضة. و لذلك تعد اشارات مركب الاسيل هوموسيرين لاكتون من اكثر المركبات انتشارا في البكتيريا سالبة الجرام. و أثبتت الدراسات مسؤولية هذه المركبات عن العديد من خصائص الضراوة لدى البكتيريا سالبة الجرام المسببة للأمراض مثل سودوموناس ايريجينوزا. ويعد هذا الكشف بمثابة وسيلة جديدة لمكافحة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية المختلفة والتي تمثل خطرا على الصحة العامة. و الجدير بالذكر أن بكتيريا سودوموناس ايريجينوزا متعددة المقاومة جاءت ضمن الميكروبات التي أعلنت منظمة الصحة العالمية خطورتها و طالبت بضرورة إيجاد بدائل للمضادات الحيوية على وجه السرعة لعلاجها.
لذلك، كان هدف الدراسة الحالية هو الإستنساخ و الإنتاج البروتيني لجين لديه القدرة على ابطال اشارات الاستشعار العددي واستخدام البروتين المنتج في الحد من ضراوة بكتيريا سودوموناس ايريجينوزا المقاومة للمضادات الحيوية.
و لتحقيق هذا الهدف، تم عزل و تكبير جين ال ahl-1 المنتج لإنزيم اللاكتونيز من سلالةB. weihenstephanensis-P65 عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات (Primers) مناسبة تم تصميمها لادخال تسلسل يتيح قطع الجين باستخدام إنزيمات القطع المتخصصة Nde1 و BamH و ذلك في بداية و نهاية التتابع النيوكليوتيدي لهذا الجين.
كذلك قامت الدراسة بمحاولات لعزل جين الاسيليز من عزلة ستربتومايسيس (Streptomyces minutiscleroticus-St62) و ذلك باستخدام بادئات مختلفة (Primers) تم تصميمها اعتمادا على البيانات التى تم تجميعها من قاعدة بيانات البنك الجيني GenBank NCBI ولكن اظهر التسلسل الجيني لنواتج التكبير لتفاعل البلمرة المتسلسل عدم تبعية أي منها لإنزيم الاسيليز او الاميديز الموجود ببكتيريا الستربتومايسيس داخل البنك الجيني بعد عما التحليلات المناسبة لها.
ولذلك استكملت الدراسة على جين ال ahl-1 الذي ينتج انزيم اللاكتونيز والذي تم فصلة من من سلالة B. weihenstephanensis-P65 .وقد تم قطع كلا من جين اللاكتونيز المعزول (ahl-1) و بلازميد pUCPU21 المستخدم كناقل في عملية نسخ الجين و ذلك باستخدام انزيمات القطع المناسبة (Nde1 و BamH1 ) و بعد ذلك تم لصق هذا الجين داخل البلازميد باستخدام الإنزيم اللاصق (T4-DNA ligase) و تخليق بلازميد pUCPU21-ahl-1 المهجن. وبعد ذلك تم ادخال البلازميد المهجن داخل ايشريشيا كولاي من نوع دي اتش-5-الفا (E. coli DH5α) وزراعتها على أطباق النمو لوري برتاني و التي تحتوي على الأمبيسيلين و تم إختيار العزلة الصحيحة وتم فصل البلازميد منها و قطعه بإنزيمات القطع ثم التأكد من وجود جين اللاكتونيزباستخدام جيل الاجاروز و عمل الفصل الكهربي. بعد ذلك تم ادخال جين اللاكتونيز المستخلص من الأجاروز في بلازميد ال pET22b الخاص بالانتاج البروتيني و من ثم تخليق البلازميد المهجن (pET22b-ahl-1) و ادخاله الي بكتيريا ايشريشيا كولاي من نوع بي ال-21-دي إي-3 E. coli BL21 DE3)). وتم التأكد من نجاح هذه الخطوة ايضا باستخدام الفصل الكهربائي لجيل الاجاروز.
بعد ذلك تم تحفيز إنتاج بروتين اللاكتونيزالمهجن باستخدام مركب الأيزوبروبيل بيتا ثيوجلاكتوزيد (IPTG)، ثم استخدام تقنية الفصل الكهربائي لأجاروز البولي اكريلاميد القاعدي (SDS-PAGE) للتأكد من انتاج البروتين المطلوب و الذي اظهرت النتائج ان أعلى انتاجية له كانت عند درجة حرارة 35 بعد 4 ساعات من التحفيز. و بعد ذلك تم تنقية بروتين اللاكتونيز المنتج باستخدام اعمدة الدورات المهجنة بالنيكل واستخدمت تقنية الفصل الكهربائي لأجاروز البولي اكريلاميد القاعدي (SDS-PAGE) للتأكد من نقاء البروتين المنتج.
بعد ذلك قامت الدراسة بالتأكد من قدرة الإنزيم المهجن المنتج على إبطال اشارات الاستشعار العددي و ذلك باستخدام مجس حيوى هو بكتيريا كروموباكتيريم فيوليشيم (CV026) و مركب هكسانويل هوموسيرين لاكتون (HHL) وأوضحت النتائج فاعلية الإنزيم في صورتيه الخام و المنقاة. كما تم قياس نشاط الإنزيم وأظهرت النتائج أن نشاط مستخلص الإنزيم الخام يساوي 77.2 وحدة نشاط إنزيمى لكل مللى جرام بروتين فى المستخلص بينما كان نشاط الانزيم المنقى 88.7 وحدة نشاط انزيمى لكل مللى جرام بروتين.
أيضا تم دراسة قدرة إنزيم اللاكتونيز المهجن على الحد من ضراوة بعض عزلات السودوموناس ايريجنوزا المقاومة للمضادات الحيوية و ذلك بعد قياس إنتاجية هذه العزلات لإشارات الاستشعار العددي. وأظهرت النتائج قدرة الإنزيم على تقليل إنتاجية عزلات السودوموناس المختبرة لكل خصائص الضراوة التي تم دراستها مثل إنزيم البروتياز و مركبات الرامنوليبيد النشطة سطحيا و مركب البيوسيانين الملون. كما أظهرت النتائج قدرة الإنزيم على الحد من حركة السرب البكتيري (swarming) و كذلك قدرة الإنزيم على تثبيط عملية تشكيل الغشاء الحيوي لدى البكتيريا المختبرة.
كما أظهرت نتائج دراسة تاثير إنزيم اللاكتونيز Ahl-1 على مقاومة بعض عزلات السودوموناس ايريجنوزا للمضادات الحيوية أن الإنزيم ليس له تأثيرمباش على مقاومة البكتيريا لأي من المضادات المختبرة كما لم يؤثر على مقدار أقل تركيز مثبط للنمو (MIC) من المضاد الحيوي أزيثروميسين و التي تم قياسها بطريقتين و بناء على ارشادات المعهد القياسي الاكلينيكي المختبري (CLSI).
و أخيرا قامت الدراسة بتقييم قدرة الإنزيم على مكافحة العدوى في نموذج حيواني، حيث تم دراسة قدرة الانزيم بعد تحضيره في صورة هيدروجيل على مجابهة عدوى سودوموناس ايريجينوزا في الحروق وذلك باستخدام فئران التجارب من نوع سويس ألبينو. وأظهرت النتائج وجود نسبة أعلى إحصائيا في عدد الحيوانات الناجية في المجموعة التي تم علاجها باستخدام الانزيم المنقى بالاضافة الى التئام افضل للجروح في هذه المجموعة و قدرة الانزيم على الحد من انتشار البكتيريا مقارنة بالمجموعات الضابطة.