الفهرس 
introduction
biosurfactantsOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 267 |  |  |
| | | from | 267 | | |
Abstract
”تحسين ورفع مستوى انتاجية الرامنوليبيد بواسطة عزلة سودوموناس إروجينوزا”
في هذه الدراسة، تم فصل أربعة وعشرين عزلة سودوموناس من ثلاثين عينة تربة لاختبار انتاجيتها للرامنوليبيد باستخدام أجار أس دبليو. وتبين ان ست من هذه العزلات قادرة على انتاج الرامنوليبيد، ومن بينهم عزلتين 4P و 6P كانتا الاكثر انتاجية و ذلك بناءا على القطر المقاس حول مستعمرات النمو و المعبر عن انتاجية الرامنوليبد. لذلك تم اختيار تلك العزلتين لفحصهما لإنتاج الرامنوليبيد في وسط نمو MSM الذي يحتوي على ٢ ٪ جلوكوز. اوضحت النتائج ان عزلة P6 اعطت اعلى مستويات من انتاجية الرامنوليبيد ولذلك تم اختيارها لمزيد من الدراسات وتعريفها باستخدام تحديد التتابع النيكلوتيدى لجين 16 اس حامض النووى الريبوسومى (RNA) على انها سودوموناس ايروجينوزا. وقد تحقق الغرض من الحصول على سلالة ذات انتاجية واعدة من الرامنوليبيد من خلال مسح عدد قليل نسبيا من العزلات حيث ان العزلة المختارة سودوموناس ايروجينوزا P6 اظهرت انتاجية مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها من خلال برنامج مسح مكثف لعدد ۱۹۰۰عزلة تمت في دراسة سابقة بمعملنا.
وقد تم دراسة تأثير العوامل المختلفة على انتاج الرامنوليبيد من العزلة P6 على مستوى القارورة الهزازة. واثبتت دراسات الإنتاج الزمنية للرامنوليبيد من العزلة P6 في وسط نمو MSM المحتوية على ٢ ٪ الجلوكوز ان اقصى انتاج كان ٢٫٥ جم/ لتر بعد ستة أيام من التحضين. و ايضا تم دراسة تأثير مكونات الوسط المغذي وظروف التخمر البيئية بهدف تحسين إنتاج الرامنوليبيد للعزلة P6. وعلى الرغم من الحصول على مستويات عالية من الرامنوليبيد باستخدام ٢ ٪ زيت فول الصويا في وسط SMSM, تم الحصول على أقصى تركيز ٦٫٧٥ جم / لتر من الرامنوليبيد باستخدام ٢ ٪ جليسرول في وسط MSM , ورمز لهزا الوسط بGMSM. وقد ثبت ان الاوساط ثنائية مصدر الكربون قادرة على انتاج الرامنوليبيد بدرجة أقل من الاوساط احادية مصدر الكربون. وفيما يتعلق بالمصادر النيتروجينية، وجد أن تركيز ٢٫٥ جم / لتر نترات الصوديوم٬ والمقابل لنسبة ٢٣٫٨٣ من مستوى الكربون الى النيتروجين٬ كان الأمثل لاعلى انتاج للرامنوليبيد. وكشفت الدراسات أن إنتاجية الرامنوليبيد باستخدام وسط GMSM كانت مرتبطة جزئيا بمعدلات النمو حيث استمرت الانتاجية فى ازدياد لمرحلة ما بعد النمو.
وباستخدام طريقة تصميم العوامل التجريبي وتحليل طريقة منهجية استجابة السطح ((RSM، وجد ان ظروف التخمير المثلى لإنتاج اعلى تركيز للرامنوليبيد في التخمير ذات الدفعة الواحدة (batch culture) على مستوى القارورة الهزازة هى درجة حرارة ٣٠ °م ، درجة اس هيدروجيني ٧٫٥، معدل تقليب ٢٥٠ دورة في الدقيقة وحجم اللقاح البكتيري ٥٪ ، حيث أسفر ذلك عن تركيز رامنوليبيد ٧٫٥ جم / لتر. وأوضحت نتائج الأنوفا للنماذج المستنبطة أن جميع العوامل المختبرة كان لها تأثير كبير على إنتاج الرامنوليبيد والكتلة الحيوية، خصوصا حجم اللقاح البكتيري ودرجة الاس الهيدروجيني ، وأن معادلات النموذج كانت ناجحة ويمكن أن تستخدم لوصف إنتاج الرامنوليبيد والكتلة الحيوية.
وفيما يتعلق بالتخمير بالتغذية المتقطعة (fed batch fermentation) للعزلة P6، كشفت دراسات القارورة الهزازة أن أفضل نظام تغذية هو الذى استخدم وسط يحتوي على ٠٫٥ مل جلسرين (نصف تركيز الجلسرين الأصلي)، ومحلول تغذية مكون من ٠٫٥ مل الجلسرين و٠٫١٢٥ مل من ٠٫٥ جم / مل نترات الصوديوم (نصف التركيز الأصلي) يضاف في كل مرة تستنفد فيها هذه الركائز. وتشير هذه النتائج إلى أن نمو العزلة P6 وإنتاج الرامنوليبيد كانتا الأفضل باستخدام خليط من الركائز في المحلول المغذي. ومن هنا تم اختيار هذا النظام لتجربته على المخمر.
علاوة على ذلك، نجحت أشعة الجاما للتطفير بتحسين انتاج الرامنوليبيد بمقدار ١٫٣ضعف ليصل إلى ٩٫٦٢ جم / لتر باستخدام الطفرة 15GR. وتعتبرهذه القيم للرامنوليبيد أعلى من معظم القيم المتحصل عليها في القارورة الهزازة التي ورد ذكرها في الدراسات السابقة، ولذلك يمكن اعتبار عزلة سودوموناس إروجينوزا P6 و الطفرة GR15 عزلات واعدة لإنتاج الرامنوليبيد على نطاق واسع.
بعد ذلك تم اختبار إنتاج الرامنوليبيد من العزلة P6 و الطفرة 15GR في المخمر المعملي (ذو سعة ١٤ لتر) باستخدام وسط GMSM والحفاظ على درجة الحرارة عند ٣٠ °م. وبدراسة حركية نمو الخلايا وإنتاج الرامنوليبيد باستخدام العزلة الأم P6 ، وجد انها موازية تقريبا لتلك التي حصلنا عليها على مستوى القارورة الهزازة لكن بمستويات اعلى في حالة المخمر. تم الحصول على الرامنوليبيد بتركيز ٨٫٦٤ جم / لتر كأقصى حد بعد ٦ أيام من التخمير في حين بلغت الكتلة الحيوية ٣٫٢ جم / لتر كأقصى حد. وقد استهلك الجلسرين بمعدل مرتفع في المرحلة اللوغارتمية لنمو البكتيريا وبمعدل أبطأ في المرحلة الثابتة للنمو، واستنفذ تماما في نهاية المدة. وعلاوة على ذلك، انخفضت نسبة الاكسجين الذائبة بشكل حاد خلال المرحلة اللوغارتمية للنمو، ثم ارتفعت مرة أخرى خلال المرحلة الثابتة للنمو، بينما ارتفعت درجة الاس الهيدروجيني قليلا خلال مرحلة النمو إلى ٧٫٤، وذلك بسبب الايض النتروجيني، ثم انخفضت لتصل إلى المستويات الأولية.
ثم تم دراسة العوامل المختلفة لتحسين إنتاج الرامنوليبيد على المخمر باستخدام العزلة P6 ، ووجد ان ظروف التخمير المثلى في التخمير ذات الدفعة الواحدة هى حجم لقاح بكتيري ٥٪ ٬ تهوية مبدئية ١حجم/حجم/دقيقة، درجة حرارة ٣٠ °م ، درجة اس هيدروجيني ٧٫٥ و ٣٥٠ دورة في الدقيقة. وأدت هذه الظروف المثلى الى اقصى كتلة حيوية ٢٫٩٧ جم / لتر ، وأقصى إنتاج للرامنوليبيد ١٠٫٣٨ جم / لتر في اليوم السادس من التحضين وأفضل معاملات تخمير (=YP / X ٣٫٦٩ جم /جم، YP / S = ٠٫٤٦ جم /جم ، YX / S = ٠٫١٣٥ جم /جم وPV = ٠٫٠٧٢جم/ لتر/ ساعة) بالمقارنة مع تجارب التخمير الأخرى التي اجريت في هذه الدراسة.
وباختبار طرق التخمير المختلفة ، وجد ان التخمير بالتغذية المتقطعة باستخدام نفس النظام الذي ثبت انه الافضل في القوارير نتج عنه أقصى كتلة حيوية (٣٫٨٥ جم / لتر) ، وأقصى تركيز للرامنوليبيد (١٣٫٦١ جم / لتر) وتحسن ١٢٪ في YP / X ليصل إلى ٤٫١٤ جم/جم.
وتم تجربة التخمير شبه المستمر في المخمر((Semicontinuous أيضا حيث تم استبدال ربع الوسط بوسط جديد بعد ثلاثة ايام من التخمر٬ وعلى الرغم من أن هذه الاستراتيجية أدت إلى كتلة حيوية قليلة تساوي ٢٫٢٣ جم / لتر، فان مستويات الرامنوليبيد (١٠٫٨٥ جم / لتر) كانت تقريبا هي نفسها التي تم الحصول عليها باستخدام التخمير ذات الدفعة الواحدة. وأدى ذلك إلى زيادة YP / X بنسبة ٤١ ٪ لتصل إلى ٥٫٢٢ جم/جم. ومع ذلك، كانت الإنتاجيات الحجمية لكل من التخمير بالتغذية المتقطعة والتخمير شبه المستمر أقل من التخمير ذات الدفعة الواحدة ويرجع ذلك إلى وقت التخمير الأطول المطلوب في هذه التجارب.
أجريت تجارب في المخمر أيضا باستخدام الطفرة GR15. وقد أدى التخمير ذات الدفعة الواحدة إلى كتلة حيوية اقل من العزلة الام تساوى ٢٫٧١ جم / لتر، ومستويات رامنوليبيد أعلى من العزلة الام تساوي ١١٫٥٦ جم / لتر ومعاملات انتاج (YP / X و YP / S) وإنتاجيات حجمية أعلى من تلك التي سجلت للعزلة الأم بمقدار ١٬٢ ضعف.
في التخمير بالتغذية المتقطعة باستخدام نفس النظام الذي أدى إلى اعلى مستويات إنتاج من قبل العزلة الام تم الحصول على أعلى مستوى من الرامنوليبيد يصل الى ١٥٫٩ جم / لتر في وقت أقصر من تلك التي سجلت للعزلة الام. وقد ادى ذلك الى زيادة YP / X ليصل إلى ٥٫١٨ جم/جم والتي هى أكبر من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام العزله الام بمقدار ١٫٣ ضغف تحت نفس ظروف التخمير. وعلاوة على ذلك، تم الشروع في التخمير شبه المستمر باستخدام استراتيجية مختلفة عن تلك المستخدمة في العزلة الام، حيث تم استبدال ربع الحجم الإجمالي ولكن بعد التوصل الى اعلى مستويات الرامنوليبيد (بعد ٦ أيام) ومرة أخرى بعد ١٠ ايام. وأدى ذلك الى اعلى مستويات الرامنوليبيد تصل الى ١٤٫٦٧جم / لتر، والحد الأقصى للكتلة الحيوية ٢٫٧ جم / لتر، وأعلى معامل انتاجYP / X يصل الى٥٫٧٣جم/جم.
بعد ذلك، تم عمل النمذجة الحركية لنمو الخلايا، وتكوين المنتج واستهلاك ركيزة النمو خلال إنتاج الرامنوليبيد من العزلة P6 والطفرة GR15. وأظهرت النتائج أن النماذج المقترحة كانت قادرة على التنبؤ بالنتائج التجريبية المتعلقة بنمو الخلايا واستهلاك الجلسرين وإنتاج الرامنوليبيد بدقة ( ٠٫٩٨ (R2 ≥.
وأخيرا وفي محاولة اخرى لزيادة محصلة انتاج الرامنوليبيد، تم اختبار إنتاجية الطفرة GR15 باستخدام تخمير الحالة الصلبة (solid state fermentation) . وقد تم اختيار مزيج من تفل قصب السكر ووجبة بذور عباد الشمس كركيزة مثلى، وأدى ذلك إلى إنتاجية قصوى للرامنوليبيد تصل الى ٢٨٫٢٥ جم / لتر من محلول التشريب (٥٦٫٥ جم / كج من المواد الصلبة الجافة الأولي) بعد ٦ أيام من التحضين عند ٣٠°م، وذلك باستخدام وسط GMSM كمحلول تشريب. وأجريت دراسة الإنتاج الزمنية لتحديد الوقت اللازم لإنتاج اعلى مستويات الرامنوليبيد ووجدت لتكون ١٠ ايام، مما أدى إلى تركيز ٣١٫٦٥ جم / لتر من محلول التشريب (٦٣٫٣ جم / كغ من المواد الصلبة \الجافة الأولي). وكانت هذه القيمة أعلى بأكثر من ٣٫٥ ضعف من القيم التي تم الحصول عليها باستخدام تخمير السائل المغمور ((SLF في القوارير، وذلك يثبت كفاءة تخمير الحالة الصلبة . وقد ادت زيادة تركيز الجلسرين في محلول التشريب ل٥ % الى تحسين تركيز الرامنوليبيد ليصل إلى ٣٧٫٢٥ جم / لتر من محلول التشريب (٧٤٫٥ غرام / كغ من المواد الصلبة الجافة الأولي).
وبواسطة تقنية دراسة منهجية استجابة السطح (RSM) تم تحديد الظروف التجريبية التي أدت إلى إنتاج اعلى نسب للرامنوليبيد باستخدام تخمير الحالة الصلبة والتي كانت كالتالي: حجم اللقاح البكتيري ١ ٪، درجة حرارة ٣٠°م ، ودرجة اس هيدروجيني أولية ٨، حيث أدى ذلك الى تركيز ٤٦٫٨٥ جم / لتر (من محلول التشريب) للرامنوليبيد. وكشفت نتائج الأنوفا أن هذه العوامل الثلاثة ذات تأثير كبير على تركيز الرامنوليبيد ، خاصة درجة الحرارة، وأن معادلة النموذج المستنبطة من دراسة منهجية استجابة السطح (RSM) يمكن أن تستخدم بنجاح لوصف إنتاج الرامنوليبيد باستخدام التخمير بالحالة الصلبة .
ومع اعادة دراسة الإنتاج الزمنية باستخدام هذه الظروف المثلى٬ تبين أن نمط إنتاج الرامنوليبيد مماثل جدا لسابقه، حيث تم الحصول على الحد الأقصى من الإنتاج في اليوم ١٠، ولكن ليصل إلى ٤٦٫٨٥جم / لتر من محلول التشريب. وكانت هذه القيمة أعلى بحوالي ٥٫٥ ضعف من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام التخمير بالسائل المغمور في القوارير (٨٬٤٥ جم / لتر) وحوالي ٣ أضعاف أعلى من أقصى إنتاجية للرامنوليبيد تم الحصول عليها باستخدام التخمير بالسائل المغمور في المخمر (١٥٫٩ غرام / لتر) لنفس الطفرة البكتيرية.
و بناءا على مجمل النتائج السابقة، فإنه يمكن الاستنتاج أن هذه الدراسة نجحت في الاتى : (ا) الحصول على عزله سودوموناس ايروجينوزا واعده لإنتاج الرامنوليبيد وتحسين إنتاجيتها للرامنوليبيد من خلال طفرة عشوائية ، (ب) تحقيق إنتاجية عالية للرامنوليبيد في القارورة الهزازة والمخمر المعملي لكل من العزله الأم والطفرة المحسنة ، (ج) تطوير طريقتين تخمر ( (microbial mass cultureالتي تجسدت في التخمير بالسائل المغمور والتخمير بالحالة الصلبة لإنتاج الرامنوليبيد من الطفرة المحسنة و (د) وصف رياضي لعملية إنتاج الرامنوليبيد في المخمر باستخدام التخمير ذو الدفعة الواحدة لكل من العزله الأم والطفرة من حيث تكوين الكتلة الحيوية ، وإنتاج الرامنوليبيد واستهلاك ركيزة النمو . والنتائج التي تم الحصول عليها تقدم دليل واضح و اسباب قوية للمضي قدما في التطوير التصاعدي لعملية الإنتاج الرامنوليبيد بواسطة عزلة السودوموناس ايروجينوزا الأم P6 و/ أو طفرتها المحسنة 15GR .